O DNA consiste em longas cadeias moleculares que carregam as instruções genéticas necessárias à vida. Na engenharia genética, os pesquisadores cortam o DNA em locais cuidadosamente selecionados e combinam esses fragmentos com outras sequências de DNA. Este processo suporta uma ampla gama de aplicações, incluindo melhor melhoramento genético, tratamento de doenças genéticas e criação de modelos animais utilizados no desenvolvimento de medicamentos.
Para unir eficientemente pequenos pedaços de DNA, os cientistas contam com sequências pendentes chamadas extremidades adesivas. Essas seções expostas ajudam os fragmentos de DNA a se unirem. No entanto, a produção de pontas adesivas perfeitas requer cortes altamente precisos em locais específicos, com os quais as tecnologias existentes nem sempre conseguem lidar bem.
Pesquisadores no Japão desenvolveram agora um método que utiliza nanopartículas de prata para cortar e unir DNA em locais específicos. Esta técnica produziu eficiências de montagem de DNA duas a cinco vezes maiores do que os métodos tradicionais de enzimas de restrição. As descobertas foram publicadas em pesquisa de ácido nucleico.
Limitações da montagem tradicional de DNA
Os métodos padrão para montar moléculas longas de DNA normalmente usam enzimas de restrição para fazer cortes e DNA ligase T4 para unir os fragmentos resultantes. No entanto, as enzimas de restrição só podem reconhecer e cortar certas sequências de DNA. Eles também criam pontas adesivas relativamente pequenas, o que pode reduzir a eficiência do processo de união.
Procurando uma alternativa, uma equipe liderada pelo professor Hiroshi Abe da Universidade de Nagoya e pelo professor assistente Masahito Inagaki, trabalhando com o professor Natsuhisa Oka da Universidade de Gifu, investigou se as reações químicas poderiam ser usadas para cortar DNA em locais selecionados, em vez de depender de enzimas de restrição.
Os pesquisadores revisitaram uma reação relatada pela primeira vez entre 1990 e 1992, na qual os íons de prata clivam o DNA modificado com 3′-tiol em locais específicos. Eles testaram se essa reação poderia ser usada para produzir pontas adesivas úteis. Os íons de prata foram eficazes no corte do DNA, mas também se ligam de forma inespecífica e causam precipitação. Como resultado, apenas 14% do ADN pôde ser recuperado, o que é demasiado baixo para aplicações práticas.
Nanopartículas de prata melhoram a recuperação do DNA
A equipe então substituiu os íons de prata por nanopartículas de prata. Os pesquisadores argumentaram que as nanopartículas poderiam ser separadas da mistura de reação por meio de centrifugação, facilitando a recuperação posterior do DNA.
Experimentos iniciais descobriram que a eficiência da fragmentação do DNA atingiu aproximadamente 50% a 70°C e aproximadamente 100% a 95°C em duas horas. No entanto, essas temperaturas podem danificar moléculas longas de DNA, representando outro obstáculo ao uso prático.
Para resolver este problema, os investigadores revestiram as nanopartículas com o polímero solúvel em água polietilenoglicol (PEG) para melhorar a sua estabilidade e dispersibilidade. O revestimento aumentou a eficiência de clivagem do DNA de 36% sem PEG para 92% a 37°C em 31 horas. “Finalmente, otimizamos as condições para um nível prático e alcançamos uma eficiência de clivagem modificada com PEG acima de 91% a 50°C em apenas uma a duas horas, sob temperatura ambiente”, disse Inagaki, primeiro autor do estudo.
A abordagem das nanopartículas proporcionou outra vantagem importante. Os fragmentos de DNA indesejados permaneceram ligados às superfícies das nanopartículas, enquanto os fragmentos desejados com extremidades adesivas permaneceram em solução. Este efeito de purificação inerente aumentou a taxa final de recuperação de DNA de 14% para 98%.
Extremidades longas e pegajosas promovem a ligação ao DNA
As nanopartículas de prata também permitiram aos pesquisadores produzir fragmentos de DNA com extremidades adesivas de 8 bases, que são difíceis de gerar usando enzimas de restrição tradicionais. Quando os cientistas usaram a DNA ligase T4 para unir esses fragmentos, a eficiência da união foi quase o dobro dos métodos tradicionais.
A melhoria tornou-se ainda maior com balanços mais longos. Usando um balanço de 18 bases, os pesquisadores alcançaram uma eficiência de união de 44%. Em comparação, um balanço convencional de 4 bases rendeu uma eficiência de apenas 8%, dando à nova abordagem uma vantagem cinco vezes maior.
Para testar se o método poderia funcionar num ambiente biológico prático, a equipe montou um fragmento de DNA que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). Eles então introduziram o DNA montado em células HeLa humanas. As células expressaram GFP com sucesso, confirmando que o DNA foi montado com precisão.
Uso potencial em terapia genética e DNA sintético
Inagaki comentou: “Acreditamos que esta tecnologia será útil para sintetizar DNA genômico, que terá muitas aplicações potenciais em áreas como o estabelecimento de bibliotecas de mRNA para vacinas contra o câncer e terapia genética, bem como o desenvolvimento de medicamentos proteicos sintéticos e culturas genômicas”.
Os investigadores querem agora determinar se a técnica pode ir além da simples junção de dois fragmentos de ADN de cada vez. Ele também explicou os próximos passos: “Mostramos que dois fragmentos de DNA podem se unir. Agora, precisamos confirmar se vários fragmentos podem se unir ao mesmo tempo – um passo fundamental para a construção de DNA em escala genômica.”
Este trabalho foi apoiado pela Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia (JST) (JPMJCR18S1, JPMJCR23N1, JP25H00427, JP24H00737, JP22H02219, JP22K21346 International Leading Research) e pela Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED) (JP22gm0010008 (LEAP). JP25ak0101289, JP223fa827 (SCADA), JP23bm1223009, JP24ek0109697, JP25ama221315, JP25ama221230; JP23fk0210133) Memorial Foundation (Precious Metals Research Grant 2021 Silver Award para MI). O financiamento para pagar as taxas de publicação de acesso aberto deste artigo foi fornecido pela Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia.
