A próxima etapa foi examinar como o complexo CRISPR interagia com eles, usando o software de dobramento de proteínas baseado em AlphaFold AI. Versões atualizadas foram projetadas para lidar com interações entre proteínas e ácidos nucléicos, bem como complexos de múltiplas proteínas. Assim, a equipe alimentou versões AlphaFold de uma sequência de DNA alvo, juntamente com um RNA guia, a sequência Cas9 e uma enzima que modifica quimicamente as bases e pode aderir ao Cas9.
Infelizmente, ele engasgou, colocando uma das proteínas no local claramente errado.
Implacável, a equipe simplificou as coisas e alimentou o AlphaFold apenas com DNA, RNA e proteína Cas9, já que este último é o principal fator que determina sua especificidade de sequência. Isso funcionou muito melhor, produzindo uma estrutura que concordava com aquelas determinadas por experimentos com ácidos nucléicos e proteínas reais.
Ao comparar as estruturas que o AlphaFold gerou quando alimentado em diferentes locais dentro e fora do alvo, os pesquisadores encontraram um padrão geral. Muitos (cerca de dois terços) dos locais fora do alvo fizeram com que a proteína Cas9 adotasse uma estrutura ligeiramente diferente. Mas quase todos (mais de 95%) alteraram quais aminoácidos entraram em contato com o RNA. Portanto, há claramente alguns casos em que Cas9 mantém sua estrutura normal, mas os aminoácidos dentro dela se flexionam de maneira a acomodar as bases mal pareadas de locais fora do alvo.
Convenientemente, o AlphaFold já foi configurado para identificar o que é chamado de “probabilidade de contato”, ou seja, a chance de dois itens quaisquer, como aminoácidos ou nucleotídeos, estarem a uma distância muito pequena (oito Angstroms). Os pesquisadores poderiam pegar o resultado da análise de probabilidade de contato para locais dentro e fora do alvo e compará-los, identificando exatamente quais aminoácidos em Cas9 alteraram os contatos quando há uma incompatibilidade entre o RNA guia e o DNA. Eles chamaram essa configuração de análise computadorizada de “ContactSeek”.
Melhor segmentação
Por si só, o ContactSeek tendia a produzir uma grande lista de aminoácidos que se deslocavam quando ligados a um local fora do alvo. Assim, os investigadores concentraram-se nas regiões da proteína Cas9 onde estes aminoácidos se agrupavam, vendo isto como um sinal de que estas áreas estavam a adaptar-se às diferenças causadas por bases incompatíveis. Eles então começaram a testar versões do Cas9 com diferentes aminoácidos nesses locais.
