Um novo microscópio desenvolvido na Universidade de Stanford permite aos cientistas ver pequenas estruturas dentro de células vivas movendo-se e interagindo em tempo real, proporcionando uma visão excepcionalmente detalhada sem os rótulos fluorescentes normalmente usados para tornar essas estruturas visíveis.
Pesquisadores de Stanford criaram um novo sistema de imagem poderoso que revela o funcionamento interno das células vivas com notável clareza. Ao combinar duas técnicas avançadas de microscopia, o instrumento atinge uma resolução de aproximadamente 120 nanômetros, um nível de detalhe sem precedentes para uma abordagem que não requer rótulos fluorescentes.
Esta técnica, conhecida como microscopia de varredura de imagem interferométrica (IISM), permite observar múltiplas estruturas celulares simultaneamente à medida que se movem, mudam e reagem ao seu entorno. Os cientistas também podem investigar o que acontece quando as células encontram medicamentos ou organismos causadores de doenças, revelando potencialmente processos biológicos que têm sido difíceis de estudar.
A descoberta é descrita na revista Nature Portfolio Luz: Ciência e AplicaçõesAvanços podem ser feitos na pesquisa do câncer, no desenvolvimento de medicamentos, em estudos de doenças infecciosas e em investigações sobre como as plantas interagem com os microrganismos.
“Este novo microscópio fornece uma visão nova e brilhante da célula, onde você pode ver as pequenas estruturas e máquinas da célula se movendo, mudando e interagindo, sem a necessidade de adicionar fluorescência para vê-las”, disse o autor sênior Vi Moerner, professor de Química Harry S. Mosher na Escola de Humanidades e Ciências de Stanford. “É uma visão incrível dessas pequenas caixas celulares complexas que comandam nossas vidas.”
Vendo o interior de células vivas sem rótulos fluorescentes
A vantagem mais importante do novo microscópio é a sua capacidade de revelar a atividade celular sem depender de marcadores fluorescentes.
Muitas técnicas atuais de microscopia usam substâncias fluorescentes para destacar estruturas específicas dentro das células. Embora esses métodos tenham transformado a pesquisa biológica, eles apresentam suas próprias limitações. Os pesquisadores normalmente conseguem rotular apenas algumas estruturas por vez, tornando difícil observar como os diferentes componentes interagem em toda a célula.
Os sinais fluorescentes também podem desaparecer durante a observação através de um processo chamado fotobranqueamento. Além disso, a introdução de rótulos pode ser um desafio, e alguns marcadores podem alterar o comportamento das estruturas que os cientistas desejam estudar.
O sistema Stanford evita esses problemas criando imagens de células sem rótulos fluorescentes. Isto permite aos investigadores observar múltiplos componentes celulares durante longos períodos de tempo enquanto observam a sua actividade num ambiente mais natural.
Outra vantagem é que o IISM requer significativamente menos potência de iluminação do que métodos comparáveis sem rótulos que produzem imagens de alto contraste. A baixa exposição à luz reduz a chance de fotodano, que ocorre quando a luz usada para geração de imagens danifica células vivas ou interfere em suas funções normais.
Embora outros microscópios especializados possam alcançar melhor resolução, a combinação de imagens detalhadas, iluminação suave e observação prolongada torna o IISM particularmente valioso para o estudo de sistemas biológicos vivos.
Os pesquisadores enfatizam que sua técnica pretende complementar e não substituir a microscopia de fluorescência.
A primeira autora, Michelle Kuypers, pós-doutoranda no laboratório de Moerner, explicou que combinar os pontos fortes de diferentes abordagens de imagem pode ajudar os cientistas a responder a questões anteriormente inacessíveis.
“Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens e acreditamos em uma implementação complementar no futuro”, disse Kuypers. “Se aproveitarmos o poder da fluorescência para a especificidade molecular e o poder do IISM para referência e dinâmica sem rótulos, poderemos realmente começar a abordar questões que antes eram difíceis de resolver.”
Como um novo microscópio alcança detalhes sem precedentes
Essa inovação veio da união de duas tecnologias de microscopia diferentes, cada uma com suas próprias vantagens.
Mörner recebeu o Prêmio Nobel de Química de 2014 por suas contribuições pioneiras à microscopia de fluorescência de super-resolução. Ele recrutou Kuypers para Stanford especificamente porque sua pesquisa de doutorado envolvia uma técnica chamada “microscopia de dispersão interferométrica”.
Este método depende de uma propriedade familiar da luz: a dispersão.
Quando a luz encontra partículas menores, ela muda de direção. O mesmo fenômeno básico explica por que o céu parece azul. À medida que a luz solar passa pela atmosfera da Terra, moléculas, poeira e gotículas de água se espalham em diferentes comprimentos de onda. Os comprimentos de onda azuis mais curtos espalham-se mais fortemente do que os comprimentos de onda vermelhos mais longos, produzindo a cor azul que vemos acima.
A microscopia de espalhamento interferométrico aproveita esse comportamento em escalas muito pequenas.
Um laser ilumina uma célula, fazendo com que pequenas estruturas dentro dela espalhem parte da luz que entra. Como o sinal espalhado é extremamente fraco, um segundo feixe de laser é usado para amplificá-lo através de interferência, permitindo que o microscópio detecte estruturas que de outra forma seriam difíceis de observar.
A equipe de Stanford melhorou essa abordagem combinando-a com tecnologia adaptada de microscópios confocal avançados.
Os microscópios confocal tradicionais usam um pequeno orifício chamado pinhole e um detector para separar a luz de uma área selecionada. Versões mais avançadas substituem esse arranjo por conjuntos de detectores baseados em câmeras, capazes de coletar múltiplas visualizações da mesma área.
Os pesquisadores incorporaram um detector de matriz em seu novo microscópio, tornando-o capaz de coletar mais luz do que um sistema convencional construído em torno de um orifício e um único detector.
Centenas de visualizações unidas para criar uma imagem mais nítida
O benefício de agregar múltiplas perspectivas é semelhante ao modo como funciona a visão humana.
Nossos dois olhos veem o mundo de posições ligeiramente diferentes, o que ajuda o cérebro a distinguir objetos próximos de objetos distantes. O microscópio de Stanford usa um princípio relacionado, mas em vez de depender apenas de dois pontos de vista, seu conjunto de detectores coleta dezenas a centenas de visualizações.
Os pesquisadores desenvolveram um método computacional que combina essas medidas para gerar imagens com maior nitidez, contraste, informações de profundidade e precisão.
Ao combinar os poderes da microscopia de dispersão interferométrica e conjuntos de detectores avançados, a equipe criou um instrumento capaz de resolver estruturas tão pequenas quanto aproximadamente 120 nanômetros.
Para fins de perspectiva, um nanômetro equivale a um bilionésimo de metro. Nessa escala, os pesquisadores podem examinar estruturas celulares extremamente pequenas e acompanhar suas atividades e interações.
É importante ressaltar que o microscópio atinge essa resolução sem sacrificar a velocidade da imagem ou exigir intensa iluminação a laser. Assim, os cientistas podem observar células vivas por longos períodos de tempo e minimizar o risco de perturbá-las ou danificá-las.
Dos medicamentos contra o cancro à malária: novas possibilidades de investigação
Mörner e Kuypers continuam a refinar o instrumento, com o objetivo de eventualmente torná-lo acessível a cientistas de muitas áreas da biologia.
Três colaborações com outros grupos de pesquisa de Stanford já estão em andamento ou em desenvolvimento, demonstrando a gama de questões que a tecnologia pode ajudar a investigar.
Um projeto utiliza microscópios para observar interações entre células vegetais, fungos e bactérias. Ao observar a interação destes organismos em tempo real, os investigadores esperam obter uma compreensão mais clara das complexas relações entre plantas e micróbios.
Outra colaboração se concentra no tratamento do câncer. Os cientistas estão a utilizar o IISM para investigar como os medicamentos contra o cancro entram nas células, fornecendo potencialmente informações valiosas sobre como os medicamentos interagem com os seus alvos.
Um terceiro projecto, ainda em fase de planeamento, investigará como os glóbulos vermelhos mudam de forma quando expostos à infecção por malária. A observação destas mudanças físicas pode fornecer novas informações sobre como a doença afeta as células sanguíneas.
Essas aplicações mostram que os pesquisadores acreditam que seu microscópio pode se tornar uma ferramenta útil em muitas disciplinas científicas, em vez de servir apenas a uma área restrita de pesquisa.
“Não é uma tecnologia específica”, disse Kuypers. “Tem amplas aplicações e esperamos que sirva bem a comunidade das ciências da vida, levando a muitas novas descobertas.”
