Pesquisadores do EMBL Hamburgo, trabalhando com cientistas do Instituto de Pesquisa Leibniz de Farmacologia Molecular (FMP), produziram um mapa incomumente detalhado de como a gripe A remodela as células humanas infectadas. Seu fluxo de trabalho personalizado permitiu observar interações proteicas diretamente dentro de células intactas, em vez de depender apenas de amostras que foram quebradas.
A gripe sazonal causa 3 a 5 milhões de casos de doenças graves em todo o mundo todos os anos e está associada a cerca de 650.000 mortes. A gripe A também gerou múltiplas pandemias, incluindo a pandemia de gripe espanhola de 1918.
Depois de entrar na célula, o vírus libera RNA contendo as instruções para produzir um pequeno conjunto de proteínas virais. Essas proteínas se espalham pela célula hospedeira e redirecionam seus sistemas moleculares, transformando a célula em um local de produção de novas partículas virais.
Mapeando o vírus da gripe dentro de células intactas
Uma visão mais clara desta aquisição poderia ajudar os cientistas a desenvolver vacinas contra a gripe e medicamentos antivirais mais eficazes. Para atingir esse objetivo, os investigadores precisam de saber quais as proteínas virais que interagem com as proteínas humanas, onde ocorrem esses contactos e como o vírus as utiliza para apoiar a sua própria replicação.
O novo estudo é o primeiro a mapear contactos diretos entre proteínas da gripe e proteínas humanas em grande escala dentro de células infectadas intactas. O detalhe estrutural também foi preciso o suficiente para que os pesquisadores modelassem como as proteínas em interação poderiam se encaixar.
“Nosso trabalho fornece uma nova maneira de estudar as interações gripe-hospedeiro em seu contexto nativo e com visão estrutural”, disse Jan Kosinski, líder do grupo no EMBL Hamburgo e no Centro de Biologia de Sistemas Estruturais (CSSB). “Os resultados atuais são um instantâneo de um momento durante a infecção e abrem a porta para o estudo das interações gripe-hospedeiro ao longo de todo o ciclo de infecção”.
Superando um grande problema experimental
Rastrear as interações proteína-proteína durante uma infecção ativa é extremamente difícil. Muitos estudos anteriores dependiam de técnicas bioquímicas que exigiam que os cientistas abrissem as células antes de medir os contatos entre proteínas.
Esse processo pode distorcer o que estava acontecendo dentro da célula viva. Uma vez destruídos os compartimentos internos, as proteínas que foram originalmente separadas podem entrar em contato no laboratório. Ao mesmo tempo, interações fracas, temporárias ou específicas de um local podem desaparecer. Como resultado, os investigadores podem ter dificuldade em determinar quais as ligações que realmente existiram durante a infecção.
“Foi quando soubemos que nossos colaboradores, Boris Bogdanow e Fan Liu, da FMP Berlim, desenvolveram uma versão especializada de espectrometria de massa de reticulação (XL-MS), uma técnica estabelecida há muito tempo para mapear contatos de proteínas, adaptada especificamente para células infectadas por vírus”, disse Kosinski.
O método especializado proporcionou o avanço que a equipe precisava. Tornou possível capturar interações que ocorrem apenas brevemente ou em regiões específicas de uma célula infectada.
“O XL-MS nos permite capturar interações proteína-proteína diretamente em células intactas infectadas, ao mesmo tempo que fornece informações estruturais sobre como essas interações estão acontecendo”, explicou Bogdanow, que agora é líder do grupo de pesquisa júnior no Instituto de Virologia, Charité – Universitätsmedizin Berlin. “Isto dá-nos uma ideia da interface entre o vírus e a célula humana e pode, através da modelação estrutural, ajudar a identificar alvos acionáveis para futuras intervenções farmacêuticas”.
Combinando dados experimentais com AlphaFold
Os pesquisadores combinaram seus resultados de XL-MS com modelagem estrutural computacional. Isto permitiu-lhes identificar proteínas virais e humanas que interagem e estimar como essas proteínas são posicionadas quando se conectam.
Para construir esses modelos estruturais, a equipe usou uma versão modificada do AlphaFold, o algoritmo de previsão de estrutura de proteínas ganhador do prêmio Nobel.
“A principal vantagem da abordagem AlphaFold modificada é que ela nos permitiu alimentar nossos dados experimentais de reticulação diretamente na modelagem estrutural”, explicou Kosinski. “Isso informa ao modelo quais partes das proteínas virais e do hospedeiro estão próximas umas das outras dentro das células infectadas. Isso foi especialmente útil para complexos vírus-hospedeiro, que muitas vezes são difíceis de prever com segurança”.
Duas maneiras pelas quais a gripe sequestra células humanas
As descobertas, publicadas em Microbiologia da Naturezarevelou duas estratégias notáveis que a gripe A parece usar ao assumir o controle de uma célula.
O primeiro centra-se na hemaglutinina, uma proteína encontrada na superfície do vírus. A gripe usa hemaglutinina para se ligar e entrar nas células hospedeiras. Os pesquisadores acompanharam essa proteína enquanto ela viajava pela rede interna de transporte e processamento da célula.
Essa rede consiste em compartimentos que dobram, modificam e preparam proteínas antes de enviá-las aos seus locais finais. A análise mostrou que várias proteínas humanas ajudaram a dobrar e modificar a hemaglutinina corretamente durante a infecção. Algumas dessas proteínas hospedeiras tinham anteriormente funções pouco compreendidas.
A gripe dissolve estruturas no núcleo
A segunda descoberta envolveu paraspeckles, pequenos compartimentos semelhantes a gotículas localizados dentro do núcleo da célula. A equipe descobriu que a infecção por influenza A causou a dissolução dessas estruturas.
Quando os paraspeckles se separaram, eles liberaram proteínas de ligação ao RNA que estavam retidas dentro deles. O vírus pode então usar essas proteínas para apoiar a sua própria replicação.
“O que mais nos surpreendeu foram os paraspeckles”, disse Iuliia Kotova, ex-bolsista de pré-doutorado do Grupo Kosinski no EMBL Hamburgo, atualmente na ETH Zurique e primeira autora da publicação. “Observar essas minúsculas organelas no núcleo se dissolverem, de forma consistente em todas as linhagens celulares e em todas as cepas de gripe que testamos, nos disse que isso não é um efeito colateral da infecção – pode ser uma estratégia”, disse ele.
A interrupção pode proporcionar à gripe mais de uma vantagem.
“Também pode haver um segundo benefício para o vírus: algumas evidências sugerem que os paraspeckles contribuem para as respostas ao estresse celular e para a regulação dos genes antivirais, portanto, interrompê-los também pode enfraquecer partes da resposta de defesa da célula”, acrescentou Kosinski.
Um esforço colaborativo entre três instituições
O projeto dependeu da partilha de tecnologia e conhecimentos de três instituições. Os pesquisadores realizaram o trabalho de espectrometria de massa de reticulação em Charité, em Berlim. As análises glicoproteômicas foram concluídas no EMBL Proteomics Core Facility.
A equipe realizou a modelagem AlphaFold no EMBL Compute Cluster, enquanto a imagem de microscopia ocorreu na Instalação Avançada de Microscopia de Luz e Fluorescência (ALFM) do CSSB.
Uma nova maneira de estudar possíveis vírus pandêmicos
As descobertas demonstram como o estudo dos contatos moleculares dentro de células infectadas intactas pode revelar onde e como um vírus assume o controle da maquinaria celular humana. Os pesquisadores dizem que esse tipo de “mapeamento no contexto” também pode ajudar a explicar como outros vírus operam.
“Embora os fatores e mecanismos exatos do hospedeiro muitas vezes difiram de vírus para vírus, acreditamos que nossa abordagem geral – combinando reticulação intracelular, modelagem estrutural e acompanhamento de biologia celular direcionada para mapear interações nativas vírus-hospedeiro em estágios específicos da infecção – permanece amplamente aplicável”, disse Kosinski.
Embora o estudo tenha examinado uma cepa de gripe adaptada em laboratório, os pesquisadores acreditam que a mesma estratégia poderia eventualmente ser usada para investigar vírus com maior potencial pandêmico.
Bogdanow concorda: “Embora este estudo tenha se concentrado em uma cepa adaptada em laboratório, este estudo estabelece as bases para aplicar a metodologia a vírus de potencial relevância pandêmica, como o H5N1, e para descobrir as redes de interação que apoiam sua multiplicação em células humanas”.
